Vätskekromatografi är huvudmetoden för att testa innehållet i varje komponent och föroreningar i råvaror, intermediärer, preparat och förpackningsmaterial, men många ämnen har inte standardmetoder att förlita sig på, så det är oundvikligt att utveckla nya metoder. Vid utvecklingen av vätskefasmetoder är den kromatografiska kolonnen kärnan i vätskekromatografin, så hur man väljer en lämplig kromatografikolonn är avgörande. I den här artikeln kommer författaren att förklara hur man väljer en vätskekromatografikolonn utifrån tre aspekter: övergripande idéer, överväganden och tillämpningsområde.
A. Övergripande idéer för att välja vätskekromatografikolonner
1. Utvärdera analytens fysikaliska och kemiska egenskaper: såsom kemisk struktur, löslighet, stabilitet (som huruvida det är lätt att oxideras/reduceras/hydrolyseras), surhet och alkalinitet, etc., speciellt den kemiska strukturen är nyckeln faktor vid bestämning av egenskaperna, såsom den konjugerade gruppen har stark ultraviolett absorption och stark fluorescens;
2. Bestäm syftet med analysen: om hög separation, hög kolonneffektivitet, kort analystid, hög känslighet, högtrycksmotstånd, lång kolonnlivslängd, låg kostnad etc. krävs;
- Välj en lämplig kromatografisk kolonn: förstå sammansättningen, fysikaliska och kemiska egenskaper hos det kromatografiska fyllmedlet, såsom partikelstorlek, porstorlek, temperaturtolerans, pH-tolerans, adsorption av analyten, etc.
- Överväganden för att välja vätskekromatografikolonner
Detta kapitel kommer att diskutera de faktorer som ska beaktas när man väljer en kromatografikolonn utifrån de fysikaliska och kemiska egenskaperna hos själva kromatografikolonnen. 2.1 Fyllnadsmatris
2.1.1 Silikagelmatris Fyllmedelsmatrisen för de flesta vätskekromatografikolonner är silikagel. Denna typ av fyllmedel har hög renhet, låg kostnad, hög mekanisk hållfasthet och är lätt att modifiera grupper (som fenylbindning, aminobindning, cyanobindning, etc.), men pH-värdet och temperaturintervallet det tolererar är begränsat: pH-intervallet för de flesta kiselgelmatrisfyllmedel är 2 till 8, men pH-intervallet för speciellt modifierade kiselgelbundna faser kan vara så brett som 1,5 till 10, och det finns även speciellt modifierade kiselgelbundna faser som är stabila vid lågt pH, såsom Agilent ZORBAX RRHD stabilbond-C18, som är stabil vid pH 1 till 8; den övre temperaturgränsen för silikagelmatrisen är vanligtvis 60 ℃, och vissa kromatografikolonner kan tolerera en temperatur på 40 ℃ vid högt pH.
2.1.2 Polymermatris Polymerfyllmedel är mestadels polystyren-divinylbensen eller polymetakrylat. Deras fördelar är att de tål ett brett pH-område – de kan användas i intervallet 1 till 14, och de är mer motståndskraftiga mot höga temperaturer (kan nå över 80 °C). Jämfört med kiseldioxidbaserade C18-fyllmedel har denna typ av fyllmedel starkare hydrofobicitet, och den makroporösa polymeren är mycket effektiv för att separera prover såsom proteiner. Dess nackdelar är att kolonneffektiviteten är lägre och den mekaniska hållfastheten är svagare än hos kiseldioxidbaserade fyllmedel. 2.2 Partikelform
De flesta moderna HPLC-fyllmedel är sfäriska partiklar, men ibland är de oregelbundna partiklar. Sfäriska partiklar kan ge lägre kolonntryck, högre kolonneffektivitet, stabilitet och längre livslängd; vid användning av mobila faser med hög viskositet (som fosforsyra) eller när provlösningen är trögflytande, har oregelbundna partiklar en större specifik yta, vilket är mer gynnsamt för de två fasernas fulla verkan, och priset är relativt lågt. 2.3 Partikelstorlek
Ju mindre partikelstorlek, desto högre kolonneffektivitet och desto högre separation, men desto sämre motståndskraft mot högt tryck. Den vanligaste kolonnen är kolonnen med 5 μm partikelstorlek; om separationskravet är högt kan ett 1,5-3 μm fyllmedel väljas, vilket bidrar till att lösa separationsproblemet för vissa komplexa matris- och flerkomponentprover. UPLC kan använda 1,5 μm fyllmedel; Fyllmedel på 10 μm eller större partikelstorlek används ofta för semipreparativa eller preparativa kolonner. 2.4 Kolinnehåll
Kolinnehåll hänvisar till andelen bunden fas på ytan av silikagel, vilket är relaterat till specifik yta och täckning av bunden fas. Högt kolinnehåll ger hög kolonnkapacitet och hög upplösning, och används ofta för komplexa prover som kräver hög separation, men på grund av den långa interaktionstiden mellan de två faserna är analystiden lång; kromatografiska kolonner med låg kolhalt har en kortare analystid och kan visa olika selektiviteter och används ofta för enkla prover som kräver snabb analys och prover som kräver höga vattenfasförhållanden. I allmänhet varierar kolhalten i C18 från 7 % till 19 %. 2.5 Porstorlek och specifik yta
HPLC-adsorptionsmedier är porösa partiklar och de flesta interaktioner äger rum i porerna. Därför måste molekyler komma in i porerna för att adsorberas och separeras.
Porstorlek och specifik yta är två kompletterande begrepp. Liten porstorlek betyder stor specifik yta och vice versa. En stor specifik yta kan öka interaktionen mellan provmolekyler och bundna faser, förbättra retention, öka provladdning och kolonnkapacitet och separation av komplexa komponenter. Helporösa fyllmedel hör till denna typ av fyllmedel. För de med höga separationskrav rekommenderas det att välja fyllmedel med stor specifik yta; liten specifik yta kan minska mottrycket, förbättra kolonneffektiviteten och minska jämviktstiden, vilket är lämpligt för gradientanalys. Kärn-skal fyllmedel tillhör denna typ av fyllmedel. Med förutsättningen att säkerställa separation, rekommenderas det att välja fyllmedel med liten specifik yta för de med höga krav på analyseffektivitet. 2.6 Porvolym och mekanisk hållfasthet
Porvolym, även känd som "porvolym", hänvisar till storleken på tomrumsvolymen per partikelenhet. Det kan väl återspegla fyllmedlets mekaniska styrka. Den mekaniska styrkan hos fyllmedel med stor porvolym är något svagare än hos fyllmedel med liten porvolym. Fyllmedel med porvolym mindre än eller lika med 1,5 mL/g används mest för HPLC-separation, medan fyllmedel med porvolym större än 1,5 mL/g huvudsakligen används för molekylär uteslutningskromatografi och lågtryckskromatografi. 2.7 Begränsningsgrad
Övertäckning kan minska svanstoppar som orsakas av interaktionen mellan föreningar och exponerade silanolgrupper (som jonbindning mellan alkaliska föreningar och silanolgrupper, van der Waals-krafter och vätebindningar mellan sura föreningar och silanolgrupper), och därigenom förbättra kolonneffektiviteten och toppformen . Okapslade bundna faser kommer att producera olika selektiviteter i förhållande till kapslade bundna faser, speciellt för polära prover.
- Användningsomfång för olika vätskekromatografikolonner
Detta kapitel kommer att beskriva tillämpningsomfånget för olika typer av vätskekromatografikolonner genom vissa fall.
3.1 Omvänd fas C18 kromatografikolonn
C18-kolonnen är den mest använda omvändfaskolonnen, som klarar innehålls- och föroreningstesterna för de flesta organiska ämnen, och är tillämpbar på medelpolära, svagt polära och opolära ämnen. Typen och specifikationen för C18-kromatografikolonnen bör väljas enligt de specifika separationskraven. Till exempel, för ämnen med höga separationskrav, används ofta 5 μm*4,6 mm*250 mm specifikationer; för ämnen med komplexa separationsmatriser och liknande polaritet kan 4 μm*4,6 mm*250 mm specifikationer eller mindre partikelstorlekar användas. Till exempel använde författaren en 3 μm * 4,6 mm * 250 mm kolumn för att detektera två genotoxiska föroreningar i celecoxib API. Separationen av de två ämnena kan nå 2,9, vilket är utmärkt. Dessutom, under förutsättningen att säkerställa separation, om snabb analys krävs, väljs ofta en kort kolonn på 10 mm eller 15 mm. Till exempel, när författaren använde LC-MS/MS för att detektera en genotoxisk förorening i piperakinfosfat API, användes en 3 μm*2,1 mm*100 mm kolonn. Separationen mellan föroreningen och huvudkomponenten var 2,0, och detekteringen av ett prov kan slutföras på 5 minuter. 3.2 Omvänd fas fenylkolonn
Fenylkolonn är också en typ av omvänd faskolonn. Denna typ av kolonn har stark selektivitet för aromatiska föreningar. Om svaret av aromatiska föreningar mätt med vanlig C18-kolonn är svagt kan du överväga att byta ut fenylkolonnen. Till exempel, när jag tillverkade celecoxib API, var huvudkomponentresponsen mätt med fenylkolonnen från samma tillverkare och samma specifikation (alla 5 μm*4,6 mm*250 mm) cirka 7 gånger den för C18-kolonnen. 3.3 Normalfas kolumn
Som ett effektivt komplement till omvänd faskolonn är normalfaskolonn lämplig för högpolära föreningar. Om toppen fortfarande är mycket snabb vid eluering med mer än 90 % vattenhaltig fas i omvändfaskolonnen, och till och med nära och överlappar lösningsmedelstoppen, kan du överväga att ersätta normalfaskolonnen. Denna typ av kolumn inkluderar hilic kolumn, amino kolumn, cyano kolumn, etc.
3.3.1 Hilic-kolonn Hilic-kolonn bäddar vanligtvis in hydrofila grupper i den bundna alkylkedjan för att förbättra responsen på polära ämnen. Denna typ av kolonn är lämplig för analys av sockerämnen. Författaren använde denna typ av kolumn när han gjorde innehållet och relaterade ämnen av xylos och dess derivat. Isomererna av ett xylosderivat kan också vara väl separerade;
3.3.2 Aminokolonn och cyanokolonn Aminokolonn och cyanokolonn hänvisar till införandet av amino- och cyanomodifikationer i slutet av den bundna alkylkedjan, för att förbättra selektiviteten för speciella ämnen: till exempel är aminokolonn ett bra val för separation av sockerarter, aminosyror, baser och amider; cyanokolonn har bättre selektivitet vid separering av hydrerade och ohydrerade strukturella liknande ämnen på grund av närvaron av konjugerade bindningar. Aminokolonn och cyanokolonn kan ofta bytas mellan normal faskolonn och omvänd faskolonn, men frekvent byte rekommenderas inte. 3.4 Kiral kolumn
Chiral kolonn, som namnet antyder, är lämplig för separation och analys av kirala föreningar, särskilt inom läkemedelsområdet. Denna typ av kolonn kan övervägas när konventionella omvändfas- och normalfaskolonner inte kan uppnå separation av isomerer. Till exempel använde författaren en 5 μm*4,6 mm*250 mm kiral kolonn för att separera de två isomererna av 1,2-difenyletylendiamin: (1S, 2S)-1, 2-difenyletylendiamin och (1R, 2R)-1, 2 -difenyletylendiamin, och separationen mellan de två nådde ca 2,0. Chirala kolonner är dock dyrare än andra typer av kolonner, vanligtvis 1W+/st. Om det finns ett behov av sådana kolumner måste enheten göra en tillräcklig budget. 3.5 Jonbytarkolonn
Jonbytarkolonner är lämpliga för separation och analys av laddade joner, såsom joner, proteiner, nukleinsyror och vissa sockerämnen. Beroende på typen av fyllmedel är de uppdelade i katjonbytarkolonner, anjonbytarkolonner och starka katjonbytarkolonner.
Katjonbytarkolonner inkluderar kalciumbaserade och vätebaserade kolonner, som främst är lämpliga för analys av katjoniska ämnen såsom aminosyror. Till exempel använde författaren kalciumbaserade kolonner när han analyserade kalciumglukonat och kalciumacetat i en spollösning. Båda substanserna hade starka svar vid λ=210nm, och separationsgraden nådde 3,0; författaren använde vätebaserade kolumner vid analys av glukosrelaterade ämnen. Flera större relaterade ämnen – maltos, maltotrios och fruktos – hade hög känslighet under differentialdetektorer, med en detektionsgräns så låg som 0,5 ppm och en separationsgrad på 2,0-2,5.
Anjonbytarkolonner är främst lämpliga för analys av anjoniska ämnen såsom organiska syror och halogenjoner; starka katjonbytarkolonner har högre jonbytarkapacitet och selektivitet och är lämpliga för separation och analys av komplexa prover.
Ovanstående är bara en introduktion till typerna och användningsområdena för flera vanliga vätskekromatografikolonner kombinerat med författarens egen erfarenhet. Det finns andra speciella typer av kromatografikolonner i faktiska applikationer, såsom kromatografikolonner med stora porer, kromatografikolonner med små porer, affinitetskromatografikolonner, multimode kromatografikolonner, ultrahögpresterande vätskekromatografikolonner (UHPLC), superkritiska vätskekromatografikolonner ( SFC), etc. De spelar en viktig roll inom olika områden. Den specifika typen av kromatografikolonn bör väljas i enlighet med provets struktur och egenskaper, separationskrav och andra syften.
Posttid: 2024-jun-14