Principer och metoder för kvantitativ analys med vätskekromatografi

Separationsmekanismen för vätskekromatografi är baserad på skillnaden i affiniteten för komponenterna i blandningen för de två faserna.

Beroende på de olika stationära faserna delas vätskekromatografi in i vätske-fast-kromatografi, vätske-vätskekromatografi och bunden faskromatografi.De mest använda är vätske-fast-kromatografi med silikagel som fyllmedel och bonded phase-kromatografi med mikrosilika som matris.

Beroende på formen av stationär fas kan vätskekromatografi delas in i kolonnkromatografi, papperskromatografi och tunnskiktskromatografi.Beroende på adsorptionskapaciteten kan den delas in i adsorptionskromatografi, partitionskromatografi, jonbyteskromatografi och gelpermeationskromatografi.

På senare år har ett högtrycksvätskeflödessystem lagts till vätskekolonnkromatografisystemet för att få mobilfasen att flyta snabbt under högt tryck för att förbättra separationseffekten, så högeffektiv (även känd som högtrycks) vätskekromatografi har framträtt.

DEL
01 Principen för kvantitativ analys av vätskekromatografi

För att kvantifiera utifrån kvalitativa, krävs rena ämnen som standarder;

Kvantifiering av vätskekromatografi är en relativt kvantitativ metod: det vill säga mängden analyt i blandningen uppskattas från en känd mängd rent standardprov

DEL
02 Grund för kvantifiering med vätskekromatografi

Mängden av den uppmätta komponenten (W) är proportionell mot svarsvärdet (A) (topphöjd eller topparea), W=f×A.

Kvantitativ korrektionsfaktor (f): Det är proportionalitetskonstanten för den kvantitativa beräkningsformeln, och dess fysiska betydelse är mängden av den uppmätta komponenten som representeras av enhetens svarsvärde (topparea).

Den kvantitativa korrektionsfaktorn kan erhållas från den kända mängden standardprov och dess svarsvärde.

Mät responsvärdet för den okända komponenten, och mängden av komponenten kan erhållas med den kvantitativa korrektionsfaktorn.

DEL
03 Vanliga termer inom kvantitativ analys

Prov (prov): en lösning innehållande en analyt för kromatografisk analys.Uppdelat i standardprover och okända prover.

Standard: En ren produkt med en känd koncentration.Okänt prov (okänd): Den blandning vars koncentration ska testas.

Provvikt: Den ursprungliga vägningen av provet som ska testas.

Spädning: Spädningsfaktorn för det okända provet.

Komponent: den kromatografiska topp som ska analyseras kvantitativt, det vill säga analyten vars innehåll är okänt.

Mängd av komponent (mängd): innehållet (eller koncentrationen) av det ämne som ska testas.

Integeritet: Beräkningsprocessen för att mäta topparean för en kromatografisk topp med en dator.

Kalibreringskurva: En linjär kurva av komponentinnehåll kontra responsvärde, fastställd från en känd mängd standardämne, som används för att bestämma det okända innehållet i analyten.

DEL
04 Kvantitativ analys av vätskekromatografi

1. Välj en kromatografisk metod som är lämplig för kvantitativ analys:

l Bekräfta toppen för den detekterade komponenten och uppnå en upplösning (R) större än 1,5

l Bestäm konsistensen (renheten) för de kromatografiska topparna för de testade komponenterna

l Bestäm detektionsgränsen och kvantifieringsgränsen för metoden;känslighet och linjärt omfång

2. Upprätta en kalibreringskurva med standardprover med olika koncentrationer

3. Kontrollera kvantitativa metoders noggrannhet och precision

4. Använd motsvarande programvara för kromatografihantering för att implementera provinsamling, databearbetning och rapportera resultat

DEL
05 Identifiering av kvantitativa toppar (kvalitativ)

Kvalitativt identifiera varje kromatografisk topp som ska kvantifieras

Använd först standardprovet för att bestämma retentionstiden (Rt) för den kromatografiska toppen som ska kvantifieras.Genom att jämföra retentionstiden, hitta den komponent som motsvarar varje kromatografisk topp i det okända provet.Den kromatografiska kvalitativa metoden är att jämföra retentionstiden med standardprovet.Kriteriet Otillräckligtytterligare bekräftelse (kvalitativ)

1. Standardadditionsmetod

2. Använd andra metoder samtidigt: andra kromatografiska metoder (ändra mekanismen, såsom: använda olika kromatografiska kolumner), andra detektorer (PDA: spektrumjämförelse, spektrumbibliotekssökning; MS: masspektrumanalys, spektrumbibliotekssökning)

3. Andra instrument och metoder

DEL
06 Bekräftelse av kvantitativ toppkonsistens

Bekräfta kromatografisk toppkonsistens (renhet)

Se till att det bara finns en uppmätt komponent under varje kromatografisk topp

Kontrollera om det finns störningar från sameluerande ämnen (föroreningar)

Metoder för bekräftelse av kromatografisk toppkonsistens (renhet)

Jämföra spektrogram med fotodiodmatrisdetektorer (PDA).

Identifiering av topprenhet

2996 Renhetsvinkelteori

Kvantitativa metoder som vanligtvis används i DEL 07

Standardkurvmetod, uppdelad i extern standardmetod och intern standardmetod:

1. Extern standardmetod: används mest vid vätskekromatografi

En serie standardprover med kända koncentrationer framställdes med användning av rena prover av föreningarna som skulle testas som standardprover.injiceras i kolonnen upp till dess svarsvärde (topparea).
Inom ett visst intervall finns ett bra linjärt samband mellan standardprovets koncentration och svarsvärdet, nämligen W= f×A , och en standardkurva görs.

Under exakt samma experimentella förhållanden, injicera det okända provet för att få svarsvärdet för den komponent som ska mätas.Enligt den kända koefficienten f kan koncentrationen av den komponent som ska mätas erhållas.

Fördelarna med den externa standardmetoden:enkel operation och beräkning, det är en vanlig kvantitativ metod;inget behov av att varje komponent detekteras och elueras;standardprov krävs;mätförhållandena för standardprov och okänt prov bör vara konsekventa;injektionsvolymen ska vara exakt.

Nackdelar med den externa standardmetoden:De experimentella förhållandena måste vara höga, såsom detektorns känslighet, flödeshastigheten och sammansättningen av den mobila fasen kan inte ändras;volymen av varje injektion bör ha god repeterbarhet.

2. Intern standardmetod: exakt, men besvärlig, används mest i standardmetoder

En känd mängd av den interna standarden läggs till standarden för att göra en blandad standard, och en serie arbetsstandarder med känd koncentration framställs.Molförhållandet mellan standard och intern standard i den blandade standarden förblir oförändrad.Injicera i den kromatografiska kolonnen och ta (standardprovets topparea/intern standardprovets topparea) som svarsvärde.Enligt det linjära sambandet mellan svarsvärdet och koncentrationen av arbetsstandarden, nämligen W= f×A , görs en standardkurva.

En känd mängd intern standard läggs till det okända provet och injiceras i kolonnen för att erhålla responsvärdet för den komponent som ska mätas.Enligt den kända koefficienten f kan koncentrationen av den komponent som ska mätas erhållas.

Egenskaperna för den interna standardmetoden:Under operationen blandas provet och den interna standarden tillsammans och injiceras i den kromatografiska kolonnen, så länge som förhållandet mellan mängden av den uppmätta komponenten och den interna standarden i den blandade lösningen är konstant, förändringen av provvolymen kommer inte att påverka de kvantitativa resultaten..Den interna standardmetoden uppväger påverkan av provvolymen, och även den mobila fasen och detektorn, så den är mer exakt än den externa standardmetoden.

DEL
08 Faktorer som påverkar kvantitativa analysresultat

Dålig noggrannhet kan orsakas av:

Felaktig toppareaintegrering, provsönderdelning eller föroreningar som införts under provberedningen, provflaskan inte förseglad, prov- eller lösningsmedelsförångning, felaktig provberedning, provinjektionsproblem, felaktig intern standardberedning

Möjliga orsaker till dålig precision:

Felaktig toppintegration, injektions- eller injektorproblem, provsönderdelning eller föroreningar som införs under provberedningen, kromatografiska problem, försämrad detektorrespons