kromatografi, även känd som "kromatografisk analys", "kromatografi", är en separations- och analysmetod, som har ett mycket brett användningsområde inom analytisk kemi, organisk kemi, biokemi och andra områden.
Grundaren av kromatografi är en rysk botaniker M.Tsvetter.1906 publicerade den ryske botanikern Zvetter resultaten av sitt experiment: För att separera växtpigment hällde han petroleumeterextrakt innehållande växtpigment i ett glasrör innehållande kalciumkarbonatpulver och eluerade det med petroleumeter uppifrån och ned.Eftersom olika pigment har olika adsorptionskapacitet på ytan av kalciumkarbonatpartiklar, med processen för urlakning, rör sig olika pigment ner med olika hastigheter och bildar sålunda band av olika färger.Pigmentkomponenterna separerades.Han kallade denna separationsmetod kromatografi.
Schematisk representation av ett växtbladpigmentseparationsexperiment
Med den kontinuerliga utvecklingen av separationsmetoder blir fler och fler färglösa ämnen föremål för separation, kromatografi förlorade också gradvis betydelsen av "färg", men namnet används fortfarande idag.
Kromatografisk klassificering
Kärnan i kromatografi är en process där molekylerna som ska separeras fördelas och balanseras mellan den stationära fasen och den mobila fasen.Olika ämnen fördelas olika mellan de två faserna, vilket gör att de rör sig i olika hastigheter med den mobila fasen.Med den mobila fasens rörelse separeras olika komponenter i blandningen från varandra på den stationära fasen.Beroende på mekanismen kan den delas in i en mängd olika kategorier.
1, enligt klassificeringen av fysiskt tillstånd i två faser
Mobil fas: Gaskromatografi, vätskekromatografi, superkritisk vätskekromatografi
Stationär fas: gas-fast, gas-vätska;Vätska-fast, flytande-vätska
2, enligt formen av stationär fasklassificering
Kolonnkromatografi: packad kolonnkromatografi, kapillärkolonnkromatografi, mikropackad kolonnkromatografi, preparativ kromatografi
Plankromatografi: papperskromatografi, tunnskiktskromatografi, polymermembrankromatografi
3, klassificerad enligt separationsmekanismen
Adsorptionskromatografi: Olika komponenter separeras enligt deras adsorptions- och desorptionskapacitet på adsorbenter
Fördelningskromatografi: De olika komponenterna separeras efter deras löslighet i lösningsmedlet
Molekylär uteslutningskromatografi: enligt storleken på molekylstorleken för separationen ln jonbyteskromatografi: olika komponenter av affiniteten för jonbytarhartsseparationen
Affinitetskromatografi: Separation med hjälp av närvaron av en specifik affinitet mellan biologiska makromolekyler
Kapillärelektrofores: komponenterna separerades i enlighet med skillnaderna i rörlighet och/eller fördelningsbeteende
Kiral kromatografi används för separation och analys av kirala läkemedel, som kan delas in i tre kategorier: kiral derivatiseringsreagensmetod;Kiral mobilfasadditivmetod;Kiral stationär fasupplösningsmetod
Grundläggande terminologi för kromatografi
Kurvorna som erhålls genom att plotta komponenternas svarssignaler efter detektion av kromatografisk separation mot tiden kallas kromatogram.
Baslinje:Under vissa kromatografiska förhållanden kallas kurvan för signalen som genereras när endast den mobila fasen passerar genom detektorsystemet baslinjen, som visas i ot-linjen.När det experimentella tillståndet var stabilt var baslinjen en linje parallell med den horisontella axeln.Baslinjen återspeglar ljudet från instrumentet, främst detektorn, över tiden.
Topphöjd:det vertikala avståndet mellan den kromatografiska topppunkten och baslinjen, betecknat med h, som visas i AB'-linjen.
Regionens bredd:Regionbredden för den kromatografiska toppen är direkt relaterad till separationseffektiviteten.Det finns tre metoder för att beskriva kromatografisk toppbredd: standardavvikelse σ, toppbredd W och FWHM W1/2.
Standardavvikelse (σ):σ är halva avståndet mellan de två inflexionspunkterna på normalfördelningskurvan, och värdet på σ indikerar graden av spridning av komponenterna bort från kolonnen.Ju större värdet på σ är, desto mer dispergerade är avloppskomponenterna och desto sämre blir separationseffekten.Omvänt är avloppskomponenterna koncentrerade och separationseffekten är god.
Toppbredd W:Skärningspunkterna på båda sidor av den kromatografiska toppen används som tangentlinjer, och skärningen på baslinjen kallas toppbredd, eller baslinjebredd, som också kan uttryckas som W, som visas i figur IJ.Enligt normalfördelningsprincipen kan förhållandet mellan toppbredd och standardavvikelse bevisas vara W=4σ.
W1/2:Toppbredden vid halva topphöjden kallas FWHM, som visas för avståndet GH.W1/2=2,355σ, W=1,699W1/2.
W1/2, W är båda härledda från σ och används för att beräkna toppareor förutom att mäta kolumneffekten.FWHM-mätning är bekvämare och vanligast.
kort sammanfattning
Från den kromatografiska topputflödeskurvan kan följande mål uppnås:
a, Kvalitativ analys utfördes baserat på retentionsvärdet för kromatografiska toppar
b, kvantitativ analys baserad på arean eller toppen av den kromatografiska toppen
C. Kolonnens separationseffektivitet utvärderades enligt retentionsvärdet och toppbredden för den kromatografiska toppen
Beräkningsformeln som ingår i kromatografi
1. Retentionsvärde
Retentionsvärdet är en parameter som används för att beskriva i vilken grad en provkomponent hålls kvar i kolonnen och används som en indikator på kromatografisk karakterisering.Dess representationsmetod är följande:
Retentionstid tR
DödstidtM
Justera retentionstiden tR'=tR-tM
(Total tid spenderad i stationär fas)
Retentionsvolym
VR=tR*F. (oberoende av mobil fashastighet)
Död volym
VM=tM*Fc
(Utrymmet som inte upptas av den stationära fasen i flödesvägen från injektorn till detektorn)
Justera retentionsvolymen VR'=t'R*Fc
2. Relativt retentionsvärde
Relativt retentionsvärde, även känt som separationsfaktor, fördelningskoefficientförhållande eller relativ kapacitetsfaktor, är förhållandet mellan den justerade retentionstiden (volymen) för den testade komponenten och den justerade retentionstiden (volymen) för standarden under vissa kromatografiska förhållanden.
Relativa retentionsvärden användes för att eliminera påverkan av vissa driftsförhållanden, såsom flödeshastighet och fixativ förlust, på retentionsvärden.Standarden i det relativa retentionsvärdet kan vara en komponent i det testade provet eller en förening som tillsatts på konstgjord väg.
3. Retentionsindex
Retentionsindex är retentionsindex för ämnet i som ska testas i en fixerad lösning X. Två n-alaner väljs ut som referensämnen, varav en har N-kolantal och den andra har N+n.Deras justerade retentionstid är t 'r (N) respektive t 'r (N+n), så att den justerade retentionstiden t 'r (i) för ämnet i som ska testas är exakt mellan dem, dvs. t'r (N).
Retentionsindex kan beräknas enligt följande.
4. Kapacitetsfaktor (k)
Vid jämvikt, förhållandet mellan massan av en komponent i den stationära fasen (s) och den mobila fasen (m), kallad kapacitetsfaktorn.Formeln är följande:
5、 Fördelningskoefficient (K) I jämvikt, förhållandet mellan koncentrationen av en komponent i den stationära fasen (s) och den mobila fasen (m), kallad fördelningskoefficient.Formeln är följande
Relationen mellan K och k:
Det återspeglar kolumntypen och dess knut viktiga egenskaper hos strukturen
kort sammanfattning
Samband mellan retentionsvärde och kapacitetsfaktor och fördelningskoefficient:
Kromatografisk separation är baserad på skillnaden i adsorptions- eller upplösningsförmågan för varje komponent i ett fixerat relativt prov, vilket kan uttryckas kvantitativt av storleken på värdet på fördelningskoefficienten K (eller kapacitetsfaktorn k).
Komponenterna med stark adsorptions- eller upplösningsförmåga har stor fördelningskoefficient (eller kapacitetsfaktor) och lång retentionstid.Omvänt har komponenterna med svag adsorption eller löslighet en liten fördelningskoefficient och en kort retentionstid.
Grundläggande teori om kromatografi
1. Brickteori
(1) Framförd - termodynamisk teori
Det började med tornplåtsmodellen som Martin och Synge föreslagit.
Fraktioneringskolonn: i facket för flera gånger gas-vätskejämvikt, beroende på kokpunkten för de olika separationerna.
Kolumn: Komponenterna balanseras av flera partitioner mellan de två faserna och separeras enligt olika partitionskoefficienter.
(2) Hypotes
(1) Det finns många brickor i kolonnen, och komponenterna kan snabbt nå fördelningsjämvikten inom brickintervallet (det vill säga höjden på brickan).
(2) Den mobila fasen går in i kolonnen, inte kontinuerligt utan pulserande, det vill säga varje passage är en kolonnvolym.
(3) När provet tillsattes till varje kolonnplatta kunde diffusionen av provet längs kolumnaxeln försummas.
(4) Fördelningskoefficienten är lika på alla brickor, oberoende av mängden komponenter.Det vill säga, partitionskoefficienten är konstant på varje taban.
(3) Princip
Schematiskt diagram över brickteori
Om en komponent av enhetsmassa, nämligen m=1 (till exempel 1mg eller 1μg), läggs till nr 0-brickan, och efter fördelningsjämvikt, eftersom k=1, nämligen ns=nm, nm=ns=0,5.
När en plåtvolym (lΔV) av bärargas kommer in i platta 0 i form av pulsering, skjuts bärgasen som innehåller nm-komponenten i gasfasen till platta 1. Vid denna tidpunkt, ns-komponenten i vätskefasen av platta 0 och nm-komponenten i gasfasen av plattan 1 kommer att omfördelas mellan de två faserna.Därför är den totala mängden komponenter som finns i plattan O 0,5, där gas- och vätskefaserna vardera är 0,25 och den totala mängden som finns i plattan 1 är också 0,5.Gas- och vätskefasen var också 0,25.
Denna process upprepas varje gång en ny plåtvolymbärargas pulseras in i kolonnen (se tabell nedan).
(4) Kromatografisk ekvation för utflödeskurvan
σ är standardavvikelsen, är retentionstiden, C är koncentrationen när som helst,
C, är injektionskoncentrationen, det vill säga den totala mängden komponenter (topparea A).
(5) kolumneffektivitetsparametrar
Vid en konstant tR, ju mindre W eller w 1/2 (det vill säga den smalare toppen), desto större är antalet teoretiska plattor n, desto mindre är den teoretiska platthöjden och desto högre är separationseffektiviteten för kolonnen.Detsamma gäller den effektiva teoribrickan neff.Därför är det teoretiska antalet brickor ett index för att utvärdera effektiviteten hos kolumner.
(5) Egenskaper och brister
> Fördelar
Brickteorin är semi-empirisk och förklarar formen på utflödeskurvan
Uppdelnings- och separationsprocesserna för komponenterna illustreras
Ett index för att utvärdera kolumnens effektivitet föreslås
> Begränsningar
Komponenterna kan inte riktigt nå fördelningsjämvikten i de två faserna:
Longitudinell diffusion av komponenter i kolonnen kan inte ignoreras:
Inverkan av olika kinetiska faktorer på massöverföringsprocessen beaktades inte.
Sambandet mellan kolonneffekt och flödeshastighet för mobil fas kan inte förklaras:
Det är inte klart vilka huvudfaktorer som påverkar kolumneffekten
Dessa problem löses på ett tillfredsställande sätt i hastighetsteorin.
2. Betygsteori
1956, den holländska forskaren VanDeemter et al.absorberade begreppet brickteori och kombinerade de kinetiska faktorerna som påverkar höjden på brickan, lade fram den kinetiska teorin om kromatografisk process-hastighetsteori och härledde VanDeemter-ekvationen.Den betraktar den kromatografiska processen som en dynamisk icke-jämviktsprocess och studerar inverkan av kinetiska faktorer på toppbreddningen (dvs kolonneffekten).
Senare har Giddings och Snyder et al.föreslog vätskekromatografihastighetsekvationen (nämligen Giddings ekvation) baserad på VanDeemter-ekvationen (senare kallad gaskromatografihastighetsekvationen) och enligt egenskapsskillnaden mellan vätska och gas.
(1) Van Deemters ekvation
Där: H: är höjden på brädan
A: virveldiffusionskoefficient
B: term för molekylär diffusionskoefficient
C: koefficient för massöverföringsresistanstermen
(2) Giddings ekvation
Kvantitativ och kvalitativ analys
(1) Kvalitativ analys
Kvalitativ kromatografisk analys är att bestämma de föreningar som representeras av varje kromatografisk topp.Eftersom olika ämnen har bestämda retentionsvärden under vissa kromatografiska förhållanden kan retentionsvärdet användas som ett kvalitativt index.Olika kromatografiska kvalitativa metoder är för närvarande baserade på retentionsvärden.
Emellertid kan olika ämnen ha liknande eller identiska retentionsvärden under samma kromatografiska förhållanden, det vill säga retentionsvärdena är inte exklusiva.Det är således svårt att karakterisera ett helt okänt prov baserat på enbart retentionsvärden.Om en preliminär bedömning av provets sammansättning kan göras på basis av förståelse av källan, arten och syftet med provet, och följande metoder kan användas för att bestämma föreningen som representeras av den kromatografiska toppen.
1. Kvalitativ kontroll med rena ämnen
Under vissa kromatografiska förhållanden har en okänd endast en definierad retentionstid.Därför kan det okända identifieras kvalitativt genom att jämföra retentionstiden för den kända rena substansen under samma kromatografiska förhållanden med retentionstiden för den okända substansen.Om de två är desamma kan det okända ämnet vara ett känt rent ämne;Annars är det okända inte det rena ämnet.
Den rena substanskontrollmetoden är endast tillämpbar på det okända ämne vars sammansättning är känd, vars sammansättning är relativt enkel och vars rena substans är känd.
2. Relativt retentionsvärdesmetod
Det relativa retentionsvärdet α, hänvisar till justeringen mellan komponent i och referensmaterial Förhållandet mellan retentionsvärden:
Den ändras bara med förändringen av fixativ och kolonntemperatur och har ingenting att göra med andra driftsförhållanden.
Vid en viss stationär fas och kolonntemperatur mäts de justerade retentionsvärdena för komponent i respektive referensämne s och beräknas sedan enligt ovanstående formel.De erhållna relativa retentionsvärdena kan kvalitativt jämföras med motsvarande värden i litteraturen.
3, tillsats av kända substanser för att öka topphöjdmetoden
När det finns många komponenter i det okända provet, är de erhållna kromatografiska topparna för täta för att lätt kunna identifieras med ovanstående metod, eller när det okända provet endast används för den specificerade artikelanalysen.
"Först görs ett kromatogram av ett okänt prov, och sedan erhålls ytterligare ett kromatogram genom att tillsätta ett känt ämne till det okända provet."Komponenter med ökade topphöjder kan vara kända för sådana ämnen.
4. Behåll indexets kvalitativa metod
Retentionsindexet representerar retentionsbeteendet hos substanser på fixativ och är för närvarande det mest använda och internationellt erkända kvalitativa indexet i GC.Det har fördelarna med god reproducerbarhet, enhetlig standard och liten temperaturkoefficient.
Retentionsindexet är endast relaterat till egenskaperna hos den stationära fasen och kolonntemperaturen, men inte till andra experimentella förhållanden.Dess noggrannhet och reproducerbarhet är utmärkt.Så länge kolonntemperaturen är densamma som den för den stationära fasen, kan litteraturvärdet användas för identifiering, och det är inte nödvändigt att använda det rena materialet för jämförelse.
(2) Kvantitativ analys
Grund för kromatografisk kvantifiering:
Uppgiften med kvantitativ analys är att hitta hundra av komponenterna i det blandade provet
Bråkdelinnehåll.Kromatografisk kvantifiering baserades på följande: när driftsförhållandena var konsekventa, var
Massan (eller koncentrationen) av den uppmätta komponenten bestäms av den svarssignal som ges av detektorn
Det är proportionellt.Nämligen:
Grund för kromatografisk kvantifiering:
Uppgiften med kvantitativ analys är att hitta hundra av komponenterna i det blandade provet
Bråkdelinnehåll.Kromatografisk kvantifiering baserades på följande: när driftsförhållandena var konsekventa, var
Massan (eller koncentrationen) av den uppmätta komponenten bestäms av den svarssignal som ges av detektorn
Det är proportionellt.Nämligen:
1. Metod för mätning av topparea
Topparea är de grundläggande kvantitativa data som tillhandahålls av kromatogram, och noggrannheten i toppareamätningen påverkar direkt de kvantitativa resultaten.Olika mätmetoder användes för kromatografiska toppar med olika toppformer.
Det är svårt att hitta det exakta värdet av vintern i kvantitativ analys:
Å ena sidan på grund av svårigheten att exakt mäta den absoluta injektionsvolymen: å andra sidan
Topparean är beroende av de kromatografiska förhållandena, och kromatografiremsan bör bibehållas när värdet mäts
Det är varken möjligt eller bekvämt att göra samma sak.Och även om du kan få det rätt
Det exakta värdet, även för att det inte finns någon enhetlig standard och inte kan tillämpas direkt.
2. Kvantitativ korrektionsfaktor
Definition av kvantitativ korrektionsfaktor: mängd komponenter som kommer in i detektorn (m)
Förhållandet mellan dess kromatografiska topparea (A) eller topphöjd () är en proportionalitetskonstant (,
Proportionalitetskonstanten kallas den absoluta korrektionsfaktorn för komponenten.
Det är svårt att hitta det exakta värdet av vintern i kvantitativ analys:
Å ena sidan på grund av svårigheten att exakt mäta den absoluta injektionsvolymen: å andra sidan
Topparean är beroende av de kromatografiska förhållandena, och kromatografiremsan bör bibehållas när värdet mäts
Det är varken möjligt eller bekvämt att göra samma sak.Och även om du kan få det rätt
Det exakta värdet, även för att det inte finns någon enhetlig standard och inte kan tillämpas direkt.
Det vill säga, den relativa korrektionsfaktorn 'för en komponent är komponenten och referensmaterialet s
Förhållandet mellan de absoluta korrektionsfaktorerna.
Det kan ses att den relativa korrektionsfaktorn är när kvaliteten på komponenten kontra standarden.
När ämnet s är lika är topparean för referensmaterialet komponentens topparea
Flera olika.Om någon komponent har massan m och topparean A, då antalet f'A
Värdena är lika med topparean för referensmaterialet med massan på.Med andra ord,
Genom den relativa korrektionsfaktorn kan toppareorna för varje komponent separeras
Omräknat till referensmaterialets topparea lika med dess massa, därefter förhållandet
Standarden är enhetlig.Så detta är den normaliserade metoden för att räkna ut procentandelen av varje komponent
Grunden för kvantitet.
Metod för att erhålla relativ korrektionsfaktor: relativa korrektionsfaktorvärden jämfördes endast med vara
Mätningen är relaterad till standarden och typen av detektor, men till operationsremsan
Det spelar ingen roll.Därför kan värden hämtas från referenser i litteraturen.Om texten
Om du inte hittar det önskade värdet i erbjudandet kan du också bestämma det själv.Metod för bestämning
Metod: En viss mängd av det uppmätta ämnet tio utvalda referensmaterial → görs till en viss koncentration
De kromatografiska toppareorna A och As för de två komponenterna mättes.
Det är formeln.
3. Kvantitativ beräkningsmetod
(1) Areanormaliseringsmetod
Summan av innehållet i alla toppfria fraktioner beräknades till 100 % för kvantifiering
Metoden kallas normalisering.Dess beräkningsformel är följande:
Där P,% är den procentuella halten av de testade komponenterna;A1, A2... A n är komponent 1. Topparean av 1~n;f'1, f'2... f'n är den relativa korrektionsfaktorn för komponenterna 1 till n.
(2) extern standardmetod
Metoden för kvantitativ jämförelse mellan svarssignalen för den komponent som ska testas i provet och den rena komponent som ska testas som kontroll.
(3) Intern standardmetod
Den så kallade internstandardmetoden är en metod där en viss mängd rent ämne tillsätts till standardlösningen av det testade ämnet och provlösningen som en intern standard, och sedan analyseras och bestäms.
(3) standardadditionsmetod
Standardadditionsmetoden, även känd som intern additionsmetoden, är att tillsätta en viss mängd (△C)
Referensen för testsubstansen sattes till provlösningen som skulle testas och testet sattes till analysen
Toppen för provlösningen efter substansen var högre än den för den ursprungliga provlösningen
Areaökningen (△A) användes för att beräkna koncentrationen av ämnet i provlösningen
Innehåll (Cx)
Där Ax är topparean för ämnet som ska mätas i originalprovet.
Posttid: Mar-27-2023